Bepaling van spectinomycine door Wayeal High Performance Liquid Chromatograph met ELSD Detector

De uitdampende lichtverspreidende detector (ELSD) is een nieuwe massa-detector met theoretische toepasbaarheid op elke verbinding die gasvormige deeltjes kan vormen.In de Pharmacopoeia van 2025 wordt het gebruik van Evaporative Light-Scattering Detection (ELSD) gespecificeerd voor de analyse en kwaliteitscontrole van meer dan 100 geneesmiddelsoorten.In de praktijk wordt ELSD vaker toegepast op verbindingen die geen ultraviolette (UV) absorptie hebben, zoals astragaloside, koolhydraten, aminoglycosiden en cholesterol.vaak een aanvullende detectiemethode voor UV- en fluorescentiedetectorenDe resultaten van ELSD worden echter beïnvloed door meerdere factoren, waaronder de samenstelling van de mobiele fase, de concentratie van het organische oplosmiddel, de elutie-modus en de nebulizeringsomstandigheden.om nauwkeurige en consistente analyseresultaten te garanderen, is het essentieel om de invloed van deze factoren op de resultaten te evalueren.
Deze studie, gebaseerd op de analysemethode voor spectinomycinehydrochloride uit Deel II van de 2025 Pharmacopoeia en gebaseerd op de ICH QbD-principes, is gebaseerd op de resultaten van een onderzoek van het ICH QbD-laboratorium.gebruikte een orthogonaal experimenteel ontwerp om de analytische omstandigheden te screenen en te optimaliseren.

Figuur 1 Spectinomycinehydrochloride

2Instrument en methode

In dit onderzoek werd een chromatografische analyse uitgevoerd met behulp van het LC3200-series HPLC-systeem van Wayeal.een kolomcompartimentDe systemen werden gecontroleerd en de gegevens verzameld/verwerkt met de SmartLab 2.0 chromatografische software.

Tabel 1 HPLC-voorwaarden

3. Bereiding van de oplossing

Proefoplossing:De klant heeft de basisoplossing van spectinomycinehydrochloride geleverd met een gemerkte concentratie van 10 mg/ml en een zuiverheid van 99,8%.

0.1M waterige oplossing van trifluorazijnzuur:Het is nodig om 6,8 ml trifluorazijnzuur nauwkeurig in een 1000 ml volumetrische kolf te pipetten, tot op het punt te verdunnen met gezuiverd water en goed te mengen.45 μm cellulose membraanfilter voor gebruik.

Standaardoplossingen:De basisoplossing werd verdund met gezuiverd water om proefoplossingen met concentraties van 0 te bereiden.15, 0.25, 0.35, 0.50Elke oplossing werd vervolgens gefilterd door een 0,45 μm cellulose membraanfilter voor gebruik.

4Resultaten en bespreking

In de Chinese Farmacopee worden identieke chromatografische omstandigheden gebruikt voor de analyse van verwante stoffen en de inhoud van de belangrijkste bestanddelen onder de vermelding spectinomycinehydrochloride.De methode stelt dat "de detector kan worden geconfigureerd op basis van de werkelijke omstandigheden." Tijdens het onderzoek, rekening houdend met de instrumentele kenmerken van de ELSD3260, de vereisten van de analysemethode en de relevante literatuur,Voor het screenen van meerdere experimentele parameters werd een Plackett-Burman-proefontwerp gebruikt (tabellen 2 en 3).Vervolgens werd een Box-Behnken-ontwerp (tabel 4) gebruikt om de piekreactie van de ELSD-detector te optimaliseren.

Tabel 2 Plackett-Burman Experimentele ontwerpen

Tabel 3 ANOVA-analyse van Plackett-Burman experimentele resultaten

Zoals blijkt uit tabel 3, vertoonden de gasstroom, de mobiele fasestroom en de postkolomcompensatie negatieve effecten.samen met het uitschakelen van post-kolom compensatieHet verlagen van de mobiele fase-stroom kan echter leiden tot verhoogde piekverruiming en verminderde detectiegevoeligheid.de doorstroming werd gehandhaafd overeenkomstig de standaardmethodeHoewel de kolomtemperatuur en de detectietemperatuur positieve effecten vertoonden, verbeterden zij de responswaarde niet aanzienlijk.Vervolgende studies zullen zich richten op het optimaliseren van de gasstroom, vernevelaartemperatuur en verdampertemperatuur.

De effecten van de gasstroom, de vernevelaar temperatuur,de reactiewaarde werd onderzocht door gebruik te maken van een experimenteel ontwerp van Box-Behnken in het kader van een reactieoppervlakte-methodologieHet experimentele ontwerp is in tabel 4 weergegeven.

Tabel 4 Box-Behnken Experimental Design

The detection conditions for spectinomycin hydrochloride were determined by simulating the peak area variation using response surface methodology (Figure 2) and considering the instrumental parameter ranges: vernevelaartemperatuur 85°C, verdampertemperatuur 80°C, detectortemperatuur 50°C en gasstroom 0,2 SLM.

A. Gevolgen van de gasstroom en de temperatuur van de verdamper op het piekgebied

B. Gevolgen van de gasstroom en de vernevelaartemperatuur op het piekgebied

C. Gevolgen van de temperatuur van de vernevelaar en de temperatuur van de verdamper op het piekgebied

Figuur 2 Variatie in piekgebied

Precisie van de injectie

De basisoplossing van spectinomycinehydrochloride werd verdund tot 0,35 mg/ml en zes opeenvolgende injecties werden uitgevoerd onder de gespecificeerde chromatografische omstandigheden met geregistreerde chromatogrammen.De relatieve standaarddeviaties (RSD%) van de retentietijd en het piekgebied voor het spectinomycinehydrochloride chromatografische piek werden berekend.De resultaten zijn weergegeven in tabel 5.

Tabel 5 Resultaten van de precisieproeven bij injectie

Specificiteit

Volgens de ICH Q2 ((R2) -richtlijn inzake validatie van analytische procedures en het hoofdstuk 9101 van de Chinese Farmacopee -richtlijnen inzake validatie van analytische methoden,de geoptimaliseerde methode is gevalideerd op specifieke kenmerken, lineair bereik, nauwkeurigheid en herhaalbaarheid.

Het gezuiverde water en de proefoplossing (0,35 mg/ml) werden geanalyseerd parallel met de opgenomen chromatogrammen.De resultaten (figuur 3) toonden geen chromatografische piek aan bij de retentietijd van spectinomycinehydrochloride in het chromatogram van het gezuiverd water., terwijl de piek voor spectinomycine hydrochloride in de monsteroplossing een baseline-scheiding van aangrenzende pieken bereikte (R > 1,5).

Figuur 3 Analyseresultaten van Spectinomycinehydrochloride Proef (0,35 mg/ml)

Lineaire reeks

Drie parallelle monsters van spectinomycinehydrochloride basisoplossing worden volgens de standaardoplossingsmethode bereid en onder chromatografische omstandigheden geanalyseerd.en de chromatogrammen registrerenRegressieanalyse met behulp van de chromatografische piekgebieden en overeenkomstige concentraties.

Figuur 4 Lineariteitstestresultaten (Log-transformed vs. niet-transformed)

Volgens de literatuur is de relatie tussen de ELSD-responswaarde en de concentratie niet-lineair.voor regressieanalyse logaritmische transformatie van zowel de responswaarde als de concentratie vereist [8].,9Na toepassing van logaritmische transformatie op de experimentele gegevens overschreed de correlatiecoëfficiënt van de lineaire regressiecurve 0.999, wat aanzienlijk beter is dan het resultaat zonder logaritmische transformatie (zie figuur 4).

Nauwkeurigheid en herhaalbaarheid

De basisoplossing spectinomycine hydrochloride werd verdund tot concentraties van 0.25, 0.35Voor elke concentratie werden drie parallelle monsters bereid, geanalyseerd onder de voorgeschreven chromatografische omstandigheden en de chromatogrammen opgenomen.Het gehalte werd berekend met behulp van de regressiecurveDe resultaten zijn weergegeven in tabel 6.

Tabel 6 Resultaten van de hersteltests

Kwantificatiegrens (LOQ)

Verdunning van de streptomycinehydrochloride basisoplossing tot een concentratie van 12 μg/ml. Analyseer het monster onder chromatografische omstandigheden en registreer het chromatogram.Bereken de signaal-ruisverhouding (S/N) van de chromatografische piek van streptomycinehydrochloride en bepaal de herhaalbaarheid ervanDe resultaten zijn weergegeven in tabel 7.

Tabel 7 LOQ-testresultaat

De resultaten tonen aan dat volgens de ICH-richtlijnvereiste van S/N > 10de relatieve standaarddeviatie van het piekgebied voor deze concentratie spectinomycinehydrochlorideoplossing voldoet aan de criteriaDaarom kan het dienen als kwantitatieve grensnorm voor spectinomycinehydrochloride.

5Conclusies

Gebaseerd op de farmacopoeiële methode heeft dit onderzoek een betrouwbare en robuuste analytische procedure voor de kwantificatie van spectinomycinehydrochloride vastgesteld.De condities van de verdampende lichtverspreidende detector (ELSD) werden systematisch geoptimaliseerdDe geoptimaliseerde methode toonde een verbeterde stabiliteit en nauwkeurigheid, een hogere detectiegevoeligheid en een bevredigend lineair bereik.

De ELSD3260-detector is een nieuw ontworpen en ontwikkelde detector voor lage temperatuur met gesplitste stroom die geschikt is voor de analyse van zowel niet-vluchtige als halfvluchtige stoffen.een waardevol alternatief bieden voor verbindingen die geen UV-absorptie hebbenIn dit onderzoek resulteerde het gebruik van de ELSD3260 voor de analyse van spectinomycinehydrochloride in uitstekende responswaarden en reproduceerbaarheid, samen met een verbeterde detectiegevoeligheid.Deze bevindingen tonen aan dat dit instrument goed geschikt is voor de kwantitatieve analyse van spectinomycinehydrochloride..