Bepaling van Methionine Hydroxy Analoog in Voer met Wayeal's High Performance Liquid Chromatography

Methionine Hydroxy Analoog (MHA) is een organisch zuuradditief dat veel wordt gebruikt in de voederindustrie als vervanging voor methionine. MHA wordt veel gebruikt in het voer van pluimvee (vleeskuikens en leghennen), varkens (biggen en mestvarkens), herkauwers (melkvee en vleesvee) en aquacultuur (vis en garnalen). Als vervanging voor methionine vertoont het significante effecten bij het verlagen van de voerkosten, het verbeteren van het darmmilieu van dieren en het versterken van de immuniteit van dieren.

Hogedrukvloeistofchromatografie gekoppeld aan UV-detectie is zeer geschikt voor de analyse van diverse complexe voermonsters, vanwege de uitstekende scheidingsefficiëntie, sterke weerstand tegen matrixinterferentie, hoge detectiegevoeligheid en stabiele en betrouwbare kwantitatieve resultaten. Dit experiment werd uitgevoerd in overeenstemming met de norm "Bepaling van Methionine Hydroxy Analoog in Voer door Hogedrukvloeistofchromatografie" (GB/T 19371-2025). Een Wayeal LC3400 serie hogedrukvloeistofchromatograaf uitgerust met een UV-detector werd gebruikt om de monster voorbehandelingsprocedure en het vloeistofchromatografische scheidings- en detectiesysteem te valideren, waardoor zowel kwalitatieve detectie als nauwkeurige kwantitatieve analyse van methionine hydroxy analoog in diverse soorten voermonsters mogelijk werd.

Trefwoorden: voer; methionine hydroxy analoog; hogedrukvloeistofchromatografie.

1. Instrumenten en Reagentia

1.1 HPLC Configuratie Lijst

Tabel 1 Lijst van Configuratie Hogedrukvloeistofchromatografie Systeem

1.2 Lijst van Reagentia en Referentiestandaarden

Tabel 2 Lijst van Reagentia en Referentiestandaarden

1.3 Vloeistofchromatografie Condities

Tabel 3 Condities Hogedrukvloeistofchromatografie

1.4 Experimentele Materialen en Hulpapparatuur

Ultrasone reiniger;

Vortex mixer;

Hoge-snelheidscentrifuge;

Analytische balans;

Shaker.

2. Experimentele Methode

2.1 Oplossingsvoorbereiding

2.1.1 Standaardcurve Oplossingen:

Weeg nauwkeurig een geschikte hoeveelheid Methionine Hydroxy Analoog referentiestandaard af en los deze op in 10% acetonitrile om een reeks standaardoplossingen te bereiden met massaconcentraties van 0.5, 1.0, 2.0, 5.0, 10.0, 20.0, 40.0 en 80.0μg/mL. Breng nauwkeurig 5mL van elke standaardoplossing over in 15mL afgesloten reageerbuizen. Voeg nauwkeurig 0.1mL van 50% kaliumhydroxide oplossing toe en vortex gedurende 15 seconden. Voeg vervolgens nauwkeurig 0.2mL van 50% fosforzuur oplossing toe en vortex gedurende nog eens 15 seconden. Centreer gedurende 5 minuten op 8000 omw/min. Leid het supernatant door een microporeus membraanfilter voor analyse.

2.1.2 Testmonster Oplossingen:

Weeg 5g voermonster af in een container, voeg 50mL van 10% acetonitrile oplossing toe en meng gedurende 30s. Plaats op een shaker en schud gedurende 30 minuten. Centreer gedurende 5 minuten op 8000 omw/min en bewaar het supernatant voor later gebruik. Breng nauwkeurig 5mL van het bovenstaande supernatant over in een 15mL afgesloten reageerbuis. Voeg nauwkeurig 0.1mL van 50% kaliumhydroxide oplossing toe en vortex gedurende 15s. Voeg vervolgens nauwkeurig 0.2mL van 50% fosforzuur oplossing toe en vortex gedurende nog eens 15s. Centreer gedurende 5 minuten op 8000 omw/min. Leid het supernatant door een microporeus membraanfilter voor analyse. Bereid twee parallelle testmonsteroplossingen voor.

2.1.3 Herstel Test Oplossingen:

Breng nauwkeurig 2.5mL van het monster supernatant en 2.5mL van elke standaardreeksoplossing over in een 15mL afgesloten reageerbuis. Voeg nauwkeurig 0.1mL van 50% kaliumhydroxide oplossing toe en vortex gedurende 15s. Voeg vervolgens nauwkeurig 0.2mL van 50% fosforzuur oplossing toe en vortex gedurende nog eens 15s. Centreer gedurende 5 minuten op 8000 omw/min. Leid het supernatant door een microporeus membraanfilter voor analyse.

3. Experimenteel Resultaat

3.1 Lineariteit en Bereik

Tabel 4 Standaardcurve Concentratie Tabel

Fig 1 Standaardcurve van Methionine Hydroxy Analoog

Opmerking: Geschikte hoeveelheden van de Methionine Hydroxy Analoog referentiestandaard oplossing werden genomen en serieel verdund tot een reeks concentraties voor de bereiding van de standaardcurve. Het lineaire bereik was 0.5–80.0 μg/mL, en de correlatiecoëfficiënt (R) was 0.99983, wat uitstekende lineariteit voor het analysemiddel aangeeft.

3.2 Precisie

Fig 2 Overlapte Chromatogrammen van Precisietest voor Referentiestandaard (20.0μg/mL)

Tabel 5 Precisietest Gegevens voor Referentiestandaard (20.0μg/mL)

Opmerking: De referentiestandaard van Methionine Hydroxy Analoog (bij een concentratie van 20.0μg/mL) werd continu geïnjecteerd voor 6 herhalingen. De herhaalbaarheid (RSD) van de retentietijd was 0.084%, en die van het piekgebied was 0.391%, wat duidt op goede instrumentprecisie.

3.3 Herstel

Fig 3 Overlapte Chromatogrammen van Hersteltest voor Methionine Hydroxy Analoog in Voer

Tabel 6 Hersteltest Gegevens voor Methionine Hydroxy Analoog in Voer

Opmerking: Het monster werd gespietst met de referentiestandaard op een concentratie van 40.0μg/mL en geanalyseerd volgens de hierboven beschreven procedure. Het verkregen herstel was 88.56%, wat duidt op een goede nauwkeurigheid van de methode.

3.4 Detectielimiet (LOD)

Fig 4 Chromatogram van Methionine Hydroxy Analoog Standaard (2.5μg/mL)

Tabel 7 Testgegevens voor Methionine Hydroxy Analoog Referentiestandaard (2.5μg/mL)

Opmerking: Op basis van de testgegevens van de Methionine Hydroxy Analoog referentiestandaard op 2.5μg/mL zoals getoond in de bovenstaande tabel, werd de theoretische detectielimiet (LOD) berekend als 0.033μg/mL bij een signaal-ruisverhouding van 3 (S/N = 3).

3.5 Test van een Voermonster

Fig 5 Chromatogram van een Voermonster

Opmerking: Methionine Hydroxy Analoog werd gedetecteerd in een voermonster met een concentratie van 0.402μg/mL.

4. Conclusie

Dit experiment werd uitgevoerd in overeenstemming met de norm "Bepaling van Methionine Hydroxy Analoog in Voer door Hogedrukvloeistofchromatografie" (GB/T 19371-2025), met behulp van de Wayeal LC3400 serie hogedrukvloeistofchromatograaf uitgerust met een UV-detector. De experimentele resultaten toonden aan dat de doelpiek goede symmetrie en een hoog theoretisch plaatgetal vertoonde. Over het concentratiebereik van 0.5–80.0μg/mL, was de correlatiecoëfficiënt (R) hoger dan 0.9998. De RSD-waarden voor retentietijd en piekgebied van de MHA referentiestandaard (20.0μg/mL) waren respectievelijk 0.084% en 0.391%, wat duidt op uitstekende instrumentprecisie. Het herstel van MHA in voermonsters gespietst op 40.0μg/mL was 88.56%, wat duidt op een goede methode nauwkeurigheid. De theoretische detectielimiet (LOD) voor MHA werd bepaald op 0.033μg/mL. MHA werd succesvol gedetecteerd in een voermonster met een concentratie van 0.402μg/mL. Alle bovenstaande gegevens voldoen aan de vereisten van de farmacopee methode voor instrumentprestaties.