Bepaling van Erythromycine Residuen in Antibiotica Fermentatie Residuen met behulp van het Wayeal LCMS-TQ9200 Vloeistofchromatografie-Massaspectrometrie Systeem

Erytromycine is een macrolide antibioticum dat wordt geproduceerd door de fermentatie van Streptomyces erythreus. Het oefent zijn antibacteriële werking voornamelijk uit door de bacteriële eiwitsynthese te remmen. De productie van erytromycine is voornamelijk afhankelijk van biofermentatietechnologie, waarbij stappen betrokken zijn zoals stamselectie, zaadcultuur, grootschalige fermentatie in tanks, extractie en zuivering. Na fermentatie wordt erytromycine geëxtraheerd met organische oplosmiddelen (zoals butylacetaat), gevolgd door zuivering door middel van kristallisatie of ionenwisselaarharsseparatie, wat uiteindelijk klinische zouten oplevert (bijv. erytromycine-ethylsuccinaat). Het productieproces van erytromycine genereert echter een aanzienlijke hoeveelheid myceliale draf (fermentatieresidu), die mogelijk restanten van antibiotica, microbiële eiwitten en metabolische bijproducten bevat. Indien deze residuen niet op de juiste manier worden beheerd, kunnen ze via milieuloos of gebruik als toevoegingsmiddelen in veevoer in de ecologische keten terechtkomen, wat tot meerdere gevaren leidt: Restanten van erytromycine kunnen de verspreiding van resistentiegenen voor antibiotica in de bodem en watermassa's bevorderen, waardoor het evenwicht van de microbiële gemeenschap wordt verstoord; versterkt via de voedselketen kan het de opkomst van resistente bacteriestammen bij dieren of mensen induceren, waardoor de werkzaamheid van antibiotica wordt ondermijnd; bovendien kan de onderbenutte organische stof in de residuen milieuvervuiling veroorzaken. Daarom is strikte regulering van myceliaal residu een cruciale maatregel voor het beheersen van vervuiling door de productie van erytromycine.

Dit experiment werd uitgevoerd met verwijzing naar de standaard "T/PIAC 00003—2021 Groepsstandaard van de China Pharmaceutical Industry Association - Methode voor de bepaling van erytromycine in antibioticaresidu, organische meststofbasismaterialen, gewassen en milieumedia", met behulp van het Wayeal LCMS-TQ9200 vloeistofchromatografie-massaspectrometriesysteem om het erytromycinegehalte in de myceliale draf te bepalen. De experimentele resultaten geven aan dat de systeemgeschiktheidstest een goede piekshape en goede lineariteit aantoonde, wat voldoet aan de experimentele vereisten.

1. Instrumenten en reagentia

1.1 Configuratie lijst van LCMS

Tabel 1 Lijst van instrumentconfiguratie

1.2 Reagentia en standaarden

Tabel 2 Lijst van reagentia en standaarden

1.3 Experimenteel materiaal en hulpapparatuur

Ultrasoon reiniger

Vortexmenger

Hoge-snelheidscentrifuge

2. Experimentele methode

2.1 Monster voorbehandeling

Weeg 0,5 g van het monster (nauwkeurig tot 0,001 g) in een glazen testbuis met stop. Voeg 50 ml acetonitril toe, vortex gedurende 1 minuut om het mengsel te homogeniseren en voer ultrasoon-ondersteunde extractie uit gedurende 20 minuten. Breng het mengsel vervolgens over in een centrifugebuis van 50 ml en centrifugeer gedurende 10 minuten bij 4000 tpm. Verzamel een geschikte hoeveelheid supernatant en leid het door een 0,22 μm filtermembraan. Gooi ten minste 1 ml van het eerste filtraat weg en breng het resterende filtraat vervolgens over in een amberkleurige LC-vial voor analyse.

2.2 Experimentele omstandigheden

2.2.1 Vloeistofchromatografiemethode omstandigheden

Chromatografiekolom: C18 1,7μm 2,1x50mm

Mobiele fase: A: Acetonitril, B: 0,1% Mierenzuur in water

Debiet: 0,3 ml/min

Kolomtemperatuur: 30℃

Injectievolume: 2μL

2.2.2 Massaspectrometer methode omstandigheden

Tabel 3 Massaspectrometrie ionenbronparameters

3. Experimenteel resultaat

3.1 Systeemgeschiktheidstest

De resultaten van de systeemgeschiktheidstest toonden goed gedefinieerde doelpieken zonder interferentie van vreemde pieken, wat voldeed aan alle experimentele vereisten.

Figuur 1 Chromatogram van Erytromycine A Standaard Werkoplossing (0,5 ng/ml)

3.2 Lineair bereik

De kalibratiecurve voor erytromycine A werd bereid door de standaardoplossing in serie te verdunnen met behulp van werkoplossingen met een tussenliggende concentratie. De curve toonde uitstekende lineariteit over het bereik van 0,5-500 ng/ml, met een correlatiecoëfficiënt (R²) groter dan 0,99.

Tabel 4 Lineair bereik van Erytromycine A

Figuur 2 Kalibratiecurve voor Erytromycine A

3.3 Detectielimiet (LOD) en kwantificatielimiet (LOQ)

In deze methode werden de detectielimiet (LOD) en de kwantificatielimiet (LOQ) voor de erytromycine A-standaardoplossing bepaald op respectievelijk 0,2 ng/ml en 0,5 ng/ml. De bijbehorende signaal-ruisverhoudingen (S/N) waren 110,02 en 292,20, wat aanzienlijk hoger is dan de minimumvereisten van 3 en 10, waardoor aan de experimentele gevoeligheidscriteria wordt voldaan.

Figuur 3. Geëxtraheerde ionenchromatogrammen voor de LOD en LOQ van Erytromycine A

3.4 Precisietest

De erytromycine A-oplossing werd achtereenvolgens zeven keer geïnjecteerd, met de resultaten weergegeven in de onderstaande figuur. De retentietijdafwijking voor erytromycine A was 0,19% en de piekarea-afwijking was 0,96%, beide lager dan 5%, wat voldoet aan de experimentele vereisten.

Figuur 4. Precisiechromatogrammen van Erytromycine A-monster (7 injecties)

3.5 Monstertest

Na de bovengenoemde voorbehandelingsmethode was het doelpiekgebied in het vaste monster 7,4E6. Berekend via de externe standaardmethode werd het erytromycine A-gehalte in de monstervloeistof bepaald op 400 ng/ml.

Figuur 5 Chromatogram van de Erytromycine A-monstertest

4. Conclusie

Deze methode maakt gebruik van het Wayeal LCMS-TQ9200 vloeistofchromatografie-massaspectrometriesysteem voor de bepaling van het erytromycine A-gehalte in antibioticumfermentatieresiduen. De gegevens geven aan dat de methode uitstekende prestaties vertoont: alle chromatografiepieken vertonen een optimale vorm zonder tailing en de gevoeligheid voldoet aan de experimentele vereisten. De lineaire correlatiecoëfficiënt (R²) overschrijdt 0,99. De retentietijd- en piekarea-afwijkingen voor alle verbindingen over zeven opeenvolgende injecties liggen binnen 1%, wat duidt op een hoge precisie. De monsterchromatogrammen vertonen geen interferentie van vreemde pieken en het gemeten monstergehalte is 400 ng/ml. Deze methode, uitgerust met het Wayeal LC-MS/MS-systeem, voldoet aan de eisen voor routinematige kwalitatieve en kwantitatieve analyse van de testmonsters.