Bepaling van restanten van amfenicol in kippenvlees door Wayeal LCMS-TQ9200

Keywords: LCMS, amfenicol, voedselveiligheid, diergeneesmiddelresiduen.

1. Instrumenten en Reagentia

1.1 Configuratie Lijst van LCMS

Tabel 1 Instrument Configuratie Lijst

1.3 Experimentele Materialen en Hulpapparatuur

Ultrasone reiniger

Vortexmenger

Stikstofverdamper met waterbad

Hogesnelheidscentrifuge

2. Experimentele Methoden

2.1 Oplossingsbereiding

2.1.1 2% Geammonieerde ethylacetaatoplossing: Neem 4 ml ammoniakwater en verdun dit tot 200 ml met ethylacetaat.

2.1.2 4% Natriumchloride-oplossing: Neem 4 g natriumchloride, los dit op in water en verdun tot 100 ml.

2.1.3 4% Natriumchloride-verzadigde n-Hexaan-oplossing: Neem een geschikte hoeveelheid 4% natriumchloride-oplossing, voeg een overmaat n-hexaan toe, meng, laat lagen scheiden en neem de bovenste n-hexaanlaag.

2.1.4 Gemengde interne standaard werkoplossing: Neem een geschikte hoeveelheid van de gemengde interne standaard stamoplossing, verdun met 20% methanol om chlooramfenicol-D5 op 10 ng/ml en andere interne standaarden (florfenicol-D3, thiamphenicol-D3 en florfenicolamine-D3) op elk 50 ng/ml te verkrijgen.

2.2 Monster Voorbehandeling

2.2.1 Monsterextractie: Weeg 2 g monster (nauwkeurig tot ±0,01 g), voeg 100 µL gemengde interne standaard werkoplossing toe, vortex gedurende 1 minuut, voeg 10 ml 2% geammonieerde ethylacetaatoplossing toe, vortex gedurende 10 minuten, centrifugeer bij 8000 rpm gedurende 5 minuten en verzamel de supernatant. Voeg nog eens 10 ml 2% geammonieerde ethylacetaatoplossing toe aan het residu en herhaal de extractieprocedure. Combineer de twee supernatanten, verdamp tot droog onder een stroom stikstof bij 50°C en bewaar voor gebruik.

2.2.2 Monsterzuivering: Voeg 3 ml 4% natriumchloride-oplossing toe aan het zuiveringsresidu, vortex om op te lossen, voeg vervolgens 5 ml 4% natriumchloride-verzadigde n-hexaan-oplossing toe, vortex gedurende 30 seconden, centrifugeer bij 8000 rpm gedurende 5 minuten en gooi de bovenste n-hexaanlaag weg. Herhaal de ontvettingprocedure eenmaal. Voeg 5 ml 2% geammonieerde ethylacetaatoplossing toe, vortex gedurende 10 minuten, centrifugeer bij 8000 rpm gedurende 5 minuten en verzamel de supernatant. Voeg nog eens 5 ml 2% geammonieerde ethylacetaatoplossing toe aan het residu en herhaal de extractieprocedure. Combineer de supernatanten, verdamp tot droog onder een stroom stikstof bij 50°C, voeg 1 ml 20% methanol-oplossing toe, vortex gedurende 30 seconden, filter door een membraan en wacht op instrumentele analyse.

2.3 Experimentele Condities

2.3.1 Vloeistofchromatografie Condities

Chromatografiekolom: C18 1,7μm 2,1x50mm

Mobiele fase: A: Acetonitril; B: 2 mM Ammoniumformiaat in Water

Debiet: 0,3 ml/min

Kolomtemperatuur: 40 ℃

Injectievolume: 5µL

2.3.2 Massaspectrometrie Condities

Tabel 3 Ionbron Parameters

3. Experimenteel Resultaat

3.1 Standaard Chromatogram

De bepaling van vier amide-antibiotica en hun interne standaarden werd binnen 6 minuten voltooid. Alle pieken vertoonden goede piekshapes zonder tailing, en elke verbinding toonde een bevredigende respons, die voldeed aan de experimentele vereisten.

Figuur 1 Chromatogram van 4 Amfenicol Antibiotica en Interne Standaard (Chlooramfenicol 0,2 ng/ml, Andere Antibiotica 1 ng/ml)

3.2 Lineair Bereik

Neem een geschikte hoeveelheid van de amide-alcohol gemengde standaardoplossing en verdun deze stapsgewijs tot een reeks concentraties om een standaardcurve te bereiden. De isotopen interne standaardmethode werd gebruikt voor kwantitatieve analyse. Het lineaire bereik was 0,2-10 ng/ml voor chlooramfenicol en 1-50 ng/ml voor florfenicolamine, thiamphenicol en florfenicol. De afwijking tussen de lineaire detectieresultaten en de bekende concentraties was minder dan de maximaal toelaatbare afwijking, met R²-waarden variërend van 0,9958 tot 0,9998, wat een uitstekende lineariteit voor alle componenten aangeeft.

Tabel 4 Lineair Bereik van Verbindingen

Figuur 2 Kalibratiecurvegegevens van de vier verbindingen

3.3 LOD en LOQ

De Chinese Nationale Voedselveiligheidsstandaard GB 31658.20-2022 specificeert dat voor deze methode de detectielimiet (LOD) voor chlooramfenicol 0,1 µg/kg is en de kwantificatielimiet (LOQ) 0,2 µg/kg; terwijl voor thiamphenicol, florfenicol en florfenicolamine de LOD 0,5 µg/kg is en de LOQ 1 µg/kg. De signaal-ruisverhoudingen voor alle doelverbindingen bij de gespecificeerde concentraties van de detectielimiet (LOD) en kwantificatielimiet (LOQ) zijn significant groter dan 3 en 10, wat voldoet aan de gevoeligheidseisen die in de nationale standaard zijn gespecificeerd.

Tabel 5 Detectie- en Kwantificatiegrenzen voor Elke Verbinding

Figuur 3 Chromatogrammen van Detectielimieten en Kwantificatiegrenzen voor Vier Verbindingen

3.4 Precisietesten

Neem lage, gemiddelde en hoge concentraties amfenicol standaardmengseloplossingen en voer zes opeenvolgende injecties uit om de afwijkingen in retentietijd en piekoppervlak te vergelijken. De resultaten worden weergegeven in de onderstaande tabel. De retentietijdafwijkingen van alle amfenicolverbindingen waren minder dan 1% en de piekoppervlakteafwijkingen waren minder dan 5%, wat voldoet aan de precisie-eis van RSD ≤ 15% gespecificeerd door de nationale standaard.

Tabel 6 Precisietest voor Elke Verbinding

Figuur 4 Precisiechromatogrammen van Vier Amide-alcohol Verbindingen

3.5 Matrix Spiking Hersteltest

De nauwkeurigheid van deze detectiemethode werd geëvalueerd met behulp van een spike-hersteltest. Voeg bekende concentraties van standaardmonsters toe aan het blanco matrixmonster in verschillende verhoudingen voor voorbehandeling, waarbij matrix-gespikede monsters worden bereid bij hoge, gemiddelde en lage concentraties. Elk concentratieniveau van de gespikede monsters werd onafhankelijk zes keer geanalyseerd. De herstelsnelheid werd berekend door de gedetecteerde concentratie in de matrix voor en na spiking te vergelijken, waardoor de nauwkeurigheid van de methode werd geëvalueerd. De resultaten worden als volgt weergegeven: in kippenmatrix varieerden de spike-herstelsnelheden van alle verbindingen van 94,5% tot 107,2%, met een CV binnen 5%, wat aangeeft dat de nauwkeurigheid voldoet aan de methode-eisen.

Tabel 6 Herstelsnelheden van Verbindingen in Gespikede Kippenmatrix

3.6 Monstertest

Willekeurig gekochte kippenborstmonsters uit supermarkten werden geëxtraheerd en gezuiverd met behulp van de bovengenoemde monster voorbehandelingsmethode. Na het testen van de monsters op het instrument werden geen van de vier amide-antibiotica gedetecteerd.

Figuur 5 Chromatogram van Vier Amide-alcohol Verbindingen in Supermarkt Kippenborstmonsters

4. Conclusie

Deze methode maakt gebruik van het Wayeal LCMS-TQ9200 vloeistofchromatografie massaspectrometriesysteem voor de bepaling van amfenicol-antibiotica in dierlijke voedingsmiddelen, waardoor gelijktijdige acquisitie van verbindingen in zowel positieve als negatieve ionenmodi mogelijk is. De gegevens geven aan dat de methode goed gevormde chromatografische pieken oplevert zonder tailing, en de gevoeligheid voldoet aan de nationale standaardvereisten. De lineaire correlatiecoëfficiënten zijn allemaal groter dan 0,99. De retentietijdafwijking voor alle verbindingen over zes opeenvolgende injecties is binnen 1% en de piekoppervlakteafwijking is binnen 5%, wat een goede precisie aantoont. De gespikede herstelsnelheden in kippenmatrix variëren van 94,5% tot 107,2%, met een CV binnen 5%, wat aangeeft dat de nauwkeurigheid voldoet aan de methodologische vereisten. Willekeurig gekochte kippenborstmonsters uit supermarkten werden geanalyseerd en geen van de vier amfenicol-antibiotica werd gedetecteerd. Dit toont aan dat de methode, uitgerust met Wayeal's vloeistofchromatografie-massaspectrometriesysteem, voldoet aan de eisen voor routinematige kwalitatieve en kwantitatieve detectie van de doelmonsters.