Bepaling van aflatoxine B₁, een kankerverwekkende stof uit groep 1, in oliehoudende gewassen met het Wayeal LCMS-TQ9200 LC-MS/MS-systeem

Aflatoxine B₁is een zeer giftige secundaire metaboliet die voornamelijk wordt geproduceerd door Aspergillus flavusen Aspergillus parasiticus. Van de aflatoxinefamilie vertoont het de sterkste toxiciteit en de breedste verspreiding. Het oefent zijn toxische effecten uit door de intracellulaire DNA- en RNA-synthese te remmen en het eiwitmetabolisme te verstoren, met een zeer gericht schadelijk effect op de lever.Vergeleken met andere mycotoxinen zoals ochratoxine en patuline, is aflatoxine B₁is uiterst giftig en heeft een bewezen carcinogeniteit. Het is geclassificeerd als een Groep 1 kankerverwekkenddoor de Wereldgezondheidsorganisatie (WHO). Het wordt vaak aangetroffen in oliehoudende gewassen zoals pinda's, maïs, noten en plantaardige oliën, waardoor het wereldwijd een prioritaire verontreiniging is voor de controle op de voedselveiligheid.

Besmetting met aflatoxine B₁treedt meestal op wanneer oliehoudende gewassen tijdens het planten, oogsten of bewaren worden blootgesteld aan hoge temperaturen en hoge luchtvochtigheid, wat de schimmelgroei bevordert. Bovendien is aflatoxine B. vanwege zijn stabiele chemische eigenschappen een goede eigenschap₁kan niet worden vernietigd door conventionele kooktemperaturen, wat leidt tot terugkerende residuproblemen in landbouwproducten en bewerkte voedingsmiddelen.

Kortdurende inname van een hoge dosis kan acute vergiftiging veroorzaken, met symptomen als hevige buikpijn, braken, geelzucht en leverfalen, wat in ernstige gevallen fataal kan zijn. Langdurige blootstelling aan lage doses leidt tot ophoping in de lever, waardoor chronische leverbeschadiging zoals leverfibrose en cirrose ontstaat, en kan zelfs primaire leverkanker veroorzaken. Populaties met een lagere immuniteit, waaronder kinderen, ouderen en personen met reeds bestaande leverziekten, lopen een hoger risico op aflatoxine B₁vergiftiging.

In China specificeert de nationale norm GB 2761-2017 (National Food Safety Standard – Maximum Levels of Mycotoxines in Foods) de maximale residulimieten voor aflatoxine B.₁in verschillende soorten voedsel. Aanvullend, GB 5009.22-2016 (Nationale voedselveiligheidsnorm – Bepaling van aflatoxinen B en G in voedingsmiddelen)biedt officiële analysemethoden voor de bepaling van aflatoxine B₁.

Deze toepassingsnota beschrijft de vaststelling van een isotopenverdunningsvloeistofchromatografie-tandemmassaspectrometrie (LC-MS/MS)-methode voor de bepaling van aflatoxine B₁met behulp van het Wayeal LCMS-TQ9200 LC-MS/MS-systeem.

Trefwoorden:Drievoudige quadrupool; Aflatoxine B₁; Isotopenverdunningsvloeistofchromatografie-tandemmassaspectrometrie.

1. Instrument en reagentia

1.1 Instrumentconfiguratie

Tabel 1 Instrumentconfiguratielijst

1.2 Reagentia en standaarden

Tabel 2 Reagentia en standaarden

1.3 Experimentmateriaal en hulpapparatuur

Vortex-mixer

Hogesnelheidscentrifuge

Analytisch evenwicht

Centrifugeer

Vaste fase extractie (SPE) spruitstuk (met vacuümpomp)

Stikstof verdamper

Shaker

2. Experimentmethode

2.1 Voorbereiding van de oplossing

2.1.1 5 mmol/L ammoniumacetaatoplossing:Weeg 0,39 g ammoniumacetaat af, los het op in water en verdun tot 1000 ml. Meng goed.

2.1.1 Methanol-acetonitril-oplossing:Voeg 100 ml acetonitril toe aan 100 ml methanol en meng vervolgens goed.

2.2 Monstervoorbehandeling

2.2.1 Monsterextractie

Giet het tarwemeel door een testzeef met een opening van 2 mm. Weeg 5 g van het monster (nauwkeurig tot 0,01 g) in een centrifugebuis van 50 ml. Voeg 100 toeμ1 isotoop interne standaardwerkoplossing (100 ng/ml), meng door vortexen en laat 30 minuten staan. Voeg 20 ml methanol-wateroplossing (70+30, v/v) toe, vortex om te mengen en schud op een rondschudapparaat gedurende 20 minuten. Centrifugeer gedurende 10 minuten bij 6000 tpm. Verzamel het supernatant voor later gebruik.

2.2.2 Monsterzuivering

Breng 4 ml van het supernatant nauwkeurig over in een container, voeg 23 ml 1% Triton X-100 in PBS toe en meng goed.

Nadat de oorspronkelijke vloeistof in de immunoaffiniteitskolom volledig is afgetapt, brengt u de bovenstaande monsteroplossing over in een injectiespuit van 50 ml. Pas de stroomsnelheid zo aan dat de monsteroplossing gestaag door de kolom stroomt met een snelheid van 1–3 ml/min. Nadat de monsteroplossing volledig is afgetapt, voegt u 2 × 10 ml water toe aan de spuitcilinder en wast u de immunoaffiniteitskolom met een constante stroomsnelheid. Nadat het water is afgetapt, droogt u de kolom met behulp van een vacuümpomp.

Koppel het vacuümsysteem los. Plaats een reageerbuisje van 10 ml met schaalverdeling onder de immunoaffiniteitskolom, verwijder de spuitcilinder van 50 ml en voeg 2 x 1 ml methanol toe om de kolom te elueren met een gecontroleerde stroomsnelheid van 1–3 ml/min. Droog de kolom vervolgens opnieuw met behulp van een vacuümpomp. Verzamel al het eluaat in de reageerbuis.Damp het eluaat voorzichtig in tot vrijwel droog onder een stroom stikstof bij 50 °C. Voeg 1 ml van de initiële mobiele fase toe en vortex gedurende 30 seconden om het residu op te lossen. Filtreer door een membraanfilter van 0,22 μm en verzamel het filtraat in een autosamplerflesje voor daaropvolgende injectie.

2.3 Experimentconditie

2.3.1 Vloeistofchromatografiemethode

Kolom: C18, 1.7μm, 2.1×50 mm

Mobiele fase Fase: A: Methanol-acetonitriloplossing; Fase B: 5 mmol/L ammoniumacetaatoplossing

Stroomsnelheid: 0,3 ml/min

Kolomtemperatuur: 40°C

Injectievolume: 3 µl

2.3.2 Massaspectrometriemethode

Tabel 3 Parameters van samengestelde massaspectrometrie

Opmerking: het sterretje (*) geeft het kwantitatieve ion aan.

3. Experimentresultaat

3.1 Standaardchromatogram

De bepaling van aflatoxine B₁en de isotoop interne standaard 13C17-aflatoxine B₁was binnen 5 minuten klaar. Zoals geïllustreerd in figuur 1 vertoonden beide analyten uitstekende piekvormen en bevredigende reacties, waarmee ze voldeden aan de vereisten voor de experimentele analyse.

Fig. 1 Chromatogrammen van aflatoxine B₁en de isotoop interne standaard 13C17​-Aflatoxine B₁

3.2 Lineair bereik

Een passend volume van de standaard stockoplossing en de gemengde isotoop interne standaard werkoplossing werden nauwkeurig overgebracht en verdund met de initiële mobiele fase om een ​​reeks standaard werkoplossingen met aflatoxine B te bereiden.₁concentraties van 50, 20, 10, 5, 2, 1 en 0,5 ng/ml. Elke oplossing bevatte de interne isotoopstandaard in een concentratie van 2 ng/ml. Met behulp van deze standaarden werd een kalibratiecurve geconstrueerd. Over het lineaire bereik van 0,5–50ng/ml, en na correctie met 13C 17-aflatoxine B₁als interne standaard: de afwijkingen tussen de gemeten en de nominale aflatoxine B₁concentraties lagen binnen de maximaal toelaatbare afwijking. De correlatiecoëfficiënt (R) was groter dan 0,999, wat een uitstekende lineariteit aangeeft.

Fig. 2 Standaardcurve van aflatoxine B₁

3.3 Herhaalbaarheid

Standaardoplossingen in drie concentraties (1, 10 en 20 ng/ml) werden zes keer achter elkaar geïnjecteerd. De resultaten worden weergegeven in de onderstaande tabel. De relatieve standaardafwijkingen (RSD's) van de retentietijden en monsterhoeveelheden voor aflatoxine B₁bij lage, gemiddelde en hoge concentraties lagen ze allemaal binnen 5%, wat voldeed aan de vereisten van het experiment.

Tabel 4 Herhaalbaarheidstest voor aflatoxine B₁bij lage, gemiddelde en hoge concentraties

3.4 Spike-herstel

Aflatoxine B₁Er werd een standaardoplossing aan het monster toegevoegd om een ​​eindconcentratie van 5 ng/ml te bereiken. Het verrijkte monster werd vervolgens geanalyseerd met LC-MS/MS. Het gemiddelde resultaat van zes opeenvolgende injecties was 5,147 ng/ml, met een RSD van 1,954%. Het berekende herstelpercentage was 102,94%, wat voldoet aan de vereisten van het experiment.

3.5 Blanco residu

Na continu injecteren van de standaardoplossing van 20 ng/ml werd vervolgens een blanco monster geïnjecteerd om de overdracht te evalueren. Zoals weergegeven in Figuur 3 werd er geen overdracht gedetecteerd in het blanco monster.

Fig. 3 Blanco chromatogram van de verbinding

3.6 Monstertest

Aflatoxine B₁werd niet gedetecteerd in monster A (figuur 4).

Fig. 4 Chromatogram van aflatoxine B₁in monster A

4. Conclusie

In deze studie werd een isotopenverdunningsvloeistofchromatografie-tandemmassaspectrometrie (LC-MS/MS)-methode gebruikt voor de bepaling van aflatoxine B₁werd tot stand gebracht met behulp van het Wayeal LCMS-TQ9200 vloeistofchromatografie-tandem massaspectrometriesysteem. De verkregen gegevens tonen aan dat alle chromatografische pieken goede piekvormen vertonen zonder staartvorming. De gevoeligheid voldoet aan de experimentele vereisten en de correlatiecoëfficiënt (R) is groter dan 0,999, wat voldoet aan de lineariteitscriteria. De herhaalbaarheid bij lage, gemiddelde en hoge concentraties ligt binnen 5%, en er wordt geen systeemoverdracht waargenomen na monsterinjectie met hoge concentratie. Deze resultaten geven aan dat de methode, indien uitgerust met het Wayeal-vloeistofchromatografie-tandemmassaspectrometriesysteem, voldoet aan de vereisten voor routinematige kwalitatieve en kwantitatieve analyse van doelmonsters.