62/2000 Bescherm de gezondheid van baby's en jonge kinderen! Wanyi ionenchromatografie bepaalt zeven soorten menselijke melk

Voorwoord

Humane melkoligosachariden (HMO's) zijn een groep oligosachariden met een polymerisatiegraad van maximaal 3, die van nature in moedermelk voorkomen; ze zijn de op twee na grootste vaste component in moedermelk, na lactose en vet. Ze reguleren de darmflora - met name door de kolonisatie van Bifidobacteriaceae in de zuigelingendarm te bevorderen - terwijl ze ook de darmgezondheid handhaven, de immuun- en hersenontwikkeling ondersteunen en anti-infectieve effecten uitoefenen, wat een belangrijke rol speelt bij de groei van zuigelingen. Sinds de lancering van de eerste met HMO's verrijkte zuigelingenvoeding in de Verenigde Staten in 2015, zijn wereldwijd een breed scala aan zuigelingenvoedingen, melk- en zuivelproducten, supplementen voor de spijsvertering en functionele voedingsmiddelen die HMO's bevatten, verkocht. Op 1 juni 2023 hebben de VS en de EU zeven HMO's goedgekeurd voor gebruik: 2'-fucosyllactose, 3'-fucosyllactose, difucosyllactose, lacto-N-neotetraose, lacto-N-tetraose, 3'-sialyllactose en 6'-sialyllactose.

Onder de gebruikelijke methoden voor HMO-detectie vereist vloeistofchromatografie een derivatisatiereactie vóór detectie, omvat complexe monsterbereiding en zijn de derivatisatiereagentia vaak giftig; de hitte-labiele aard van HMO's leidt ook tot een lage respons en slechte herhaalbaarheid in LC-MS. Daarentegen biedt ionenchromatografie met amperometrische detectie voor koolhydraten een eenvoudige monsterbereiding, hoge respons en goede herhaalbaarheid, waardoor het duidelijke voordelen heeft voor HMO-analyse. Deze applicatienota gebruikt handmatig bereide natriumhydroxide, natriumacetaat en ultrapuur water als eluaten, en maakt gebruik van de WAYEAL IC6300 ionenchromatograaf om HMO's in zuigelingenvoeding te bepalen. De methode kenmerkt zich door eenvoudige monsterbereiding, hoge gevoeligheid en goede lineariteit, en biedt een nuttige referentie voor HMO-detectie in voedingsmiddelen.

Trefwoorden: ionenchromatograaf; humane melkoligosachariden; amperometrische detector.

1. Instrumenten, Apparatuur en Reagentia

1.1 Reagentia en Standaarden

Tabel 1. Lijst van reagentia en standaarden

1.2 Laboratoriummaterialen en Hulpapparatuur

• 1.2.1 Analytische balans (afleesbaarheid 0,1 mg);
• 1.2.2 Thermostatisch waterbad;
• 1.2.3 Centrifuge;
• 1.2.4 Waterige polyethersulfon (PES) membraanfilters (0,45 µm);
• 1.2.5 Ultrapuur water;
• 1.2.6 Vacuümfiltratieapparaat;
• 1.2.7 RP vaste-fase-extractie (SPE) voorbehandelingscartridges;
• 1.2.8 Wegwerpspuiten (20 ml, 5 ml).

2. Experimentele Methode

2.1 Oplossingsbereiding

• 2.1.1 200 mmol/L natriumhydroxideoplossing: Pipetteer 10,5 ml 50% NaOH, verdun met water tot 1000 ml en filter onder vacuüm.
• 2.1.2 Gemengde oplossing van 75 mmol/L NaOH en 250 mmol/L natriumacetaat: Weeg nauwkeurig 20,51 g natriumacetaat af, los op in water en breng over naar een maatkolf van 1000 ml; pipetteer nauwkeurig 3,95 ml 50% NaOH, verdun tot 1000 ml met ultrapuur water en filter onder vacuüm.
• 2.1.3 3% sulfosalizylzuuroplossing: Weeg 3,0 g sulfosalizylzuur af, los op in water en verdun tot 100 ml (vers bereiden).
• 2.1.4 Gemengde standaard stockoplossing: Weeg nauwkeurig elk 5 mg 2'-fucosyllactose, 3'-fucosyllactose, 3'-sialyllactose, 6'-sialyllactose, lacto-N-tetraose en lacto-N-neotetraose af (op de dichtstbijzijnde 0,1 mg), plaats in een maatkolf van 10 ml, los op in water en verdun tot de streep om een gemengde stock van 500 mg/L te bereiden. Weeg afzonderlijk 1 mg difucosyllactose af (op de dichtstbijzijnde 0,1 mg), plaats in een maatkolf van 10 ml, los op en verdun tot de streep om een stock van 100 mg/L te bereiden.
• 2.1.5 Gemengde standaard werkoplossingen: Pipetteer nauwkeurig de gemengde stockoplossing (2.1.4) in maatkolven en verdun met water om gemengde werkoplossingen van 2'-FL, 3'-FL, 3'-SL, 6'-SL, LNT, LNnT en DFL te bereiden met concentraties van 0,5, 2, 4, 6, 8 en 10 mg/L. Vers bereiden voor gebruik.

2.2 Monsterbereiding

Weeg ongeveer 2,0 g monster af in een klein bekerglas, meng grondig met 50 ml warm water (ongeveer 50 °C), voeg 40 ml 3% sulfosalizylzuuroplossing toe, breng over en verdun tot 100 ml in een maatkolf, en soniceer gedurende 10 minuten. Filter door filterpapier of centrifugeer (12.000 omw/min, 15 minuten). Leid de monsteroplossing door een RP SPE-cartridge en vervolgens door een 0,45 µm waterfilter; gooi de eerste 3 ml weg en verzamel het eluaat voor analyse. Conditioneer de RP SPE-cartridge vóór gebruik met 20 ml methanol gevolgd door 15 ml water, en equilibreer gedurende 30 minuten.

2.3 Experimentele Omstandigheden

2.3.1 Ionenchromatografie-omstandigheden

3. Resultaten

3.1 Lineair Bereik

Een geschikte hoeveelheid van elke gemengde standaard werkoplossing werd geanalyseerd. Het lineaire bereik was 0,5-10 mg/L; afwijkingen tussen gemeten en nominale concentraties lagen binnen de maximaal toegestane afwijking, R²-waarden waren hoger dan 0,999, en alle componenten vertoonden een goede lineariteit.

Tabel 2. Lineaire bereiken van de verbindingen

Figuur 1. Overlappende kalibratiechromatogrammen van de zeven HMO-standaarden

3.2 Testresultaten van Monsters

Monsters 1 en 2 werden getest na 10-voudige verdunning. Het gehalte van elk van de zeven HMO's werd als volgt berekend: X is het gehalte in het monster (mg/100g); c is de concentratie in de monsteroplossing uit de kalibratiecurve (mg/L); V is het constante volume (ml); m is de monster massa (g); f is de verdunningsfactor. De berekende gehaltes (mg/100g) zijn als volgt:

Figuur 2. Ionenchromatogram van Monster 1 10-voudig verdund

Figuur 3. Ionenchromatogram van Monster 2 10-voudig verdund

Tabel 3. Testresultaten van monsters

3.3 Precisie

De werkoplossing op het vierde kalibratieniveau werd geanalyseerd in zes opeenvolgende injecties onder de omstandigheden in 2.3.1. De RSD van de zeven HMO-gehaltes werd berekend om de herhaalbaarheid te evalueren. De onderstaande resultaten geven een goede methodeprecisie aan.

3.3.1 Precisie van Standaard Herhaalbaarheid

Testresultaten:

Figuur 4. Overlappende chromatogrammen van onafhankelijke herhaalde injecties van kalibratiestandaard S4

Tabel 4. Precisie van herhaalbaarheid van de standaard

3.4 Detectie- en Kwantificeringslimieten

LOD: Hoeveelheden van de standaardoplossing werden verdund tot een gemengde oplossing met 10 µg/L 3'-FL, 30 µg/L DFL, 30 µg/L 2'-FL, 22 µg/L LNnT, 67 µg/L LNT, 67 µg/L 6'-SL en 160 µg/L 3'-SL; 20 parallelle monsters werden bereid en geanalyseerd.

LOQ: Hoeveelheden van de standaardoplossing werden verdund tot een gemengde oplossing met 30 µg/L 3'-FL, 80 µg/L DFL, 90 µg/L 2'-FL, 65 µg/L LNnT, 200 µg/L LNT, 200 µg/L 6'-SL en 500 µg/L 3'-SL; zes parallelle monsters werden bereid en geanalyseerd.

De testresultaten zijn als volgt:

Tabel 5. S/N resultaten voor LOD en LOQ van de zeven HMO's

3.5 Specificiteit

Hoeveelheden (elk 100 µl) van standaardoplossingen van glucose, fructose, sucrose en maltose werden toegevoegd aan een maatkolf van 10 ml en verdund tot de streep met Monster 2 oplossing 67-voudig verdund. De oplossing werd geanalyseerd om te controleren of deze suikers de pieken van de zeven HMO's verstoorden. Zoals hieronder getoond, vertoonden de vier suikers geen significante interferentie met de bepaling van de zeven HMO's in het melkpoeder.

Figuur 5. Overlappende chromatogrammen van kalibratie S6, Monster 2, en Monster 2 aangevuld met de vier suikerstandaarden

4. Conclusie

Deze validatie gebruikte de WAYEAL ionenchromatograaf om de methode voor het bepalen van HMO's in voedingsmiddelen te verifiëren. De gegevens tonen aan dat alle chromatografische pieken goed gevormd zijn zonder halvering; 2'-FL, 3'-FL, DFL, LNnT, LNT, 6'-SL en 3'-SL elueren allemaal binnen 60 minuten; de gevoeligheid voldoet aan de nationale normvereisten; en de lineaire correlatiecoëfficiënten zijn allemaal groter dan 0,999. De herhaalbaarheid van zowel standaarden als monsters is goed. Behalve de twee sialyllactoses bevinden de LOD en LOQ zich op het niveau van µg/L. De methode heeft een goede specificiteit, zonder storende onzuiverheden, en voldoet over het algemeen aan de normvereisten.